Introducción al ADN
La razón que explica que se puedan construir plantas transgénicas
es la presencia universal de ADN (ácido desoxirribonucleico)
en las células de todos los organismos vivos. Esta molécula
almacena la información genética del organismo y organiza
los procesos metabólicos de la vida. La información genética
es especificada por la secuencia de cuatro bases químicas
(adenina, citosina, guanina y timina) a lo largo de la molécula
de ADN. Los genes son segmentos separados de ADN que codifican
la información necesaria para conjuntar una proteína específica.
Las proteínas funcionan entonces como enzimas que catalizan
reacciones bioquímicas, o como unidades estructurales o de
almacenamiento de una célula, y contribuyen a la expresión
de una característica de la planta. En el diagrama siguiente
se muestra la secuencia general de acontecimientos mediante
los cuales la información codificada en el ADN es expresada
en forma de proteínas por conducto de un ARNm (ácido ribonucleico
mensajero) intermediario.
Los procesos de transcripción y traducción son controlados
por un complejo conjunto de mecanismos reguladores, de tal
modo que se produce una determinada proteína sólo cuando y
donde es necesaria. Para más información sobre genética molecular,
consulte cualquier texto reciente de genética o el sitio Web
Access Excellence, Graphics Gallery http://www.accessexcellence.org/ . Aun especies que
son muy diferentes tienen mecanismos similares para convertir
la información del ADN en proteínas; por consiguiente, un
segmento de ADN proveniente de bacterias puede ser interpretado
y traducido como una proteína funcional cuando se lo inserta
en una planta.
 Entre los instrumentos
más importantes del equipo del ingeniero genético están las
enzimas que desempeñan funciones específicas en el ADN. La
imagen que está a la izquierda (Voet,
Donald 1995 Biochemistry) muestra la estructura del ADN
como una doble hélice con el elemento fundamental de fosfato
de color amarillo verdoso y las bases en blanco o azul verdoso
oscuro. Las figuras azules y rojas representan la estructura
tridimensional de una enzima de restricción (EcoR1), que reconoce
y corta el ADN en una región específica de éste. Otras enzimas
llamadas ligasas unen los extremos de dos fragmentos de ADN.
Éstas y otras enzimas permiten la manipulación y amplificación
del ADN y son elementos esenciales para unir los ADN de dos
organismos no emparentados.
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Localización de los genes que determinan las características
de las plantas
La identificación y localización
de los genes que determinan características importantes desde
el punto de vista agrícola es la etapa más limitante en el
proceso transgénico. Todavía sabemos relativamente poco acerca
de los genes específicos necesarios para aumentar el potencial
de rendimiento, mejorar la tolerancia a los factores desfavorables,
modificar las propiedades químicas del producto cosechado
o de alguna otra forma afectar las características de la planta.
En general, no basta identificar a un solo gen relacionado
con una característica; los científicos deben conocer cómo
está regulado el gen, qué otros efectos podría tener en la
planta y cómo interactúa con otros genes activos en la misma
vía bioquímica. Los programas públicos y privados de investigación
están invirtiendo mucho en tecnologías nuevas que permitan
establecer con rapidez la secuencia y determinar las funciones
de los genes de las especies cultivadas más importantes. Estos
esfuerzos deben conducir a la identificación de una gran cantidad
de genes en potencia útiles para producir variedades transgénicas.
No se incluyen en este sitio
Web las técnicas para localizar y establecer la secuencia
de los tramos de ADN que controlan características específicas.
Se remite al lector interesado a Klug
y Cummings, 1998, Lewin,
1999; Wong,
1997, u otros textos recientes sobre genética.
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Diseño de genes para la inserción
Una vez que se ha aislado y clonado (amplificado en un vector
bacteriano) un gen, debe ser sometido a varias modificaciones
antes de que pueda ser efectivamente insertado en una planta.
Representación
simplificada de un transgen construido, que contiene los
componentes necesarios para la integración y expresión con
éxito.
- Es preciso agregar una secuencia promotora para que el
gen sea expresado correctamente (es decir, traducido como
un producto proteínico). El promotor es la llave de encendido
y apagado que controla cuándo y dónde se expresará el gen
en la planta. Hasta la fecha, la mayoría de los promotores
en las variedades de cultivos transgénicos han sido "constitutivos",
es decir, que causan la expresión del gen durante todo el
ciclo biológico de la planta en la mayoría de los tejidos.
El promotor constitutivo usado más comúnmente es CaMV35S,
proveniente del virus del mosaico de la coliflor, que generalmente
produce un alto grado de expresión en las plantas. Otros
promotores son más específicos y responden a señales indicadoras
en el medio interno o externo de la planta. Un ejemplo de
un promotor inducible por la luz es el promotor del gen
"cab", que codifica la principal proteína fijadora de clorofilas
a y b.
- A veces, el gen clonado es modificado para lograr una
mayor expresión en una planta. Por ejemplo, el gen Bt para
la resistencia a los insectos es de origen bacteriano y
tiene un porcentaje más elevado de pares de nucleótidos
A-T, en comparación con las plantas, que prefieren los pares
de nucleótidos G-C. En una modificación inteligente, los
investigadores sustituyeron los nucleótidos A-T con nucleótidos
G-C en el gen Bt, sin modificar considerablemente la secuencia
de aminoácidos. El resultado fue una mayor producción del
producto génico en las células de la planta.
- La secuencia de terminación indica a la maquinaria celular
que se ha alcanzado el final de la secuencia génica.
- Se agrega un gen marcador seleccionable al "constructo"
génico con el fin de identificar las células o tejidos de
la planta que han integrado con éxito el transgen. Esto
es necesario porque rara vez se produce la incorporación
y expresión de transgenes en células de plantas, que se
logran en apenas un pequeño porcentaje de los tejidos o
células beneficiarios. Los genes marcadores seleccionables
codifican proteínas que proporcionan resistencia a agentes
normalmente tóxicos para las plantas, como los antibióticos
o herbicidas. Como se explica más adelante, sólo las células
vegetales que han integrado el gen marcador seleccionable
sobrevivirán cuando se las cultive en un medio que contenga
el antibiótico o herbicida pertinente. En cuanto a otros
genes insertados, los genes marcadores también requieren
secuencias promotoras y de terminación para funcionar en
forma apropiada.
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Transformación de las plantas
La transformación es un cambio heredable en una célula u
organismo, producido por la absorción y establecimiento del
ADN introducido. Hay dos métodos principales para transformar
las células y tejidos de las plantas:
- El método de "la pistola de genes" (también conocido como
bombardeo con microproyectiles o biolística). Esta técnica,
que se muestra y explica en la sección de demostración animada
de este sitio Web, ha sido especialmente útil en la transformación
de especies de monocotiledóneas como el maíz y el arroz.
- El método con Agrobacterium, que se describe a continuación.
La transformación empleando Agrobacterium ha sido practicada
con éxito en dicotiledóneas (plantas de hojas anchas como
la soya y el tomate) durante muchos años, pero sólo recientemente
ha sido efectuada en monocotiledóneas (gramíneas y sus parientes).
En general, el método con Agrobacterium es considerado preferible
a la pistola de genes porque es mayor la frecuencia de inserciones
en un solo sitio del ADN extraño, lo cual facilita la vigilancia.
El método de transformación de plantas con Agrobacterium
Agrobacterium tumefaciens es una notable especie
de bacterias que viven en el suelo y tienen la capacidad de
infectar las células de las plantas con un fragmento de su
ADN. Cuando el ADN bacteriano se integra en un cromosoma de
la planta, se apodera efectivamente de la maquinaria celular
de ésta y la usa para asegurar la proliferación de la población
bacteriana. Muchos jardineros y propietarios de huertos están
por desgracia familiarizados con A. tumefaciens porque
éste causa enfermedades caracterizadas por agallas de la corona
en muchas plantas ornamentales y frutales.
Agalla
de la corona de la frambuesa causada por Agrobacterium
tumefaciens.
Fuente: Universidad
Estatal de Ohio
Diagrama de la célula de Agrobacterium
tumefaciens
El ADN de una célula de A. tumefaciens está contenido
en el cromosoma bacteriano y en otra estructura llamada plásmido
Ti (inductor de tumores). El plásmido Ti contiene:
- un segmento de ADN llamado ADN-T (~20 kb de largo) que
es transferido a la célula de la planta en el proceso de
la infección.
- una serie de genes vir (de la virulencia) que dirigen
el proceso de la infección.
La bacteria A. tumefaciens sólo puede infectar a
una planta a través de lesiones. Cuando la raíz o el tallo
de una planta sufre una lesión, emite ciertas señales químicas.
En respuesta a esas señales los genes vir de A. tumefaciens
se activan y dirigen una serie de acontecimientos necesarios
para la transferencia del ADN-T desde el plásmido Ti al cromosoma
de la planta. Distintos genes vir:
- Copian el ADN-T.
- Unen un producto a la hebra del ADN-T copiado para que
actúe como líder.
- Agregan proteínas a lo largo del ADN-T, posiblemente como
mecanismo de protección.
- Abren un canal en la membrana celular bacteriana a través
del cual pasa el ADN-T.
El ADN-T entra entonces en la célula de la planta a través
de la lesión. No está claro cómo el ADN bacteriano se traslada
desde el citoplasma al núcleo de la célula de la planta, ni
cómo el ADN-T se integra en el cromosoma de la planta. Recuerde
que la mayoría de las veces el ADN de la planta no existe
como una hebra expuesta sino que está envuelto con las proteínas
histonas y tiene una estructura superarrollada. Una hipótesis
es que el ADN-T espera hasta que el ADN de la planta está
siendo replicado o transcripto y entonces se inserta en el
ADN expuesto de la planta (Galun
and Breiman, 1997).
Para utilizar A. tumefaciens como vector del transgen, los
científicos han eliminado la sección de ADN-T inductora de
tumores y han conservado las regiones fronterizas del ADN-T
y los genes vir. El transgen es insertado entre las regiones
fronterizas del ADN-T, desde donde es transferido a la célula
de la planta para integrarse en los cromosomas de ésta (Wong, 1997).
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Selección y regeneración
Selección de tejidos transformados con éxito. Después
del proceso de inserción del gen, los tejidos de la planta
son transferidos a un medio selectivo que contiene un antibiótico
o un herbicida, según el marcador seleccionable que se usó.
Sólo las plantas que expresan el gen marcador seleccionable
sobrevivirán, como se muestra en la figura, y se supone que
estas plantas también poseerán el transgen de interés. Por
lo tanto, en los pasos subsiguientes del proceso se utilizarán
únicamente estas plantas sobrevivientes.
Cuando
se los cultiva en medios selectivos, sólo sobrevivirán los
tejidos de las plantas que han integrado con éxito el constructo
del transgen.
Regeneración de plantas completas. Para obtener plantas
completas a partir de tejidos transgénicos como los embriones
inmaduros, se cultivan éstos en condiciones ambientales controladas
en una serie de medios que contienen nutrimentos y hormonas,
proceso conocido como cultivo de tejidos. Una vez que se generan
plantas completas y éstas producen semillas, comienza la evaluación
de la progenie. Este paso de la regeneración ha sido un obstáculo
al producir plantas transgénicas en muchas especies, pero
ahora se pueden transformar y regenerar variedades específicas
de la mayoría de los cultivos.
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Cultivo
de tejidos de plantas transgénicas en una cámara con
condiciones ambientales controladas.
Fuente: Departamento de Agricultura de los Estados Unidos
de América
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Avances futuros en la tecnología transgénica
Las técnicas nuevas para producir plantas transgénicas mejorarán
la eficiencia del proceso y contribuirán a mitigar algunas
de las inquietudes en cuanto a efectos sobre el medio ambiente
y la salud. Entre los cambios previstos están los siguientes:
- Una transformación más eficiente, es decir, un porcentaje
más elevado de células de la planta incorporarán con éxito
el transgen.
- Mejores genes marcadores para reemplazar el empleo de
genes de la resistencia a antibióticos.
- Mejor control de la expresión génica mediante promotores
más específicos, de tal modo que el gen insertado será activo
sólo cuando y donde se requiera.
- Transferencia de fragmentos de ADN de múltiples genes
para modificar caracteres más complejos.
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El fitomejoramiento
y las pruebas
Un elemento intrínseco de la producción de plantas transgénicas
es el extenso proceso de evaluación para verificar si el gen
insertado se ha incorporado de manera estable sin efectos
nocivos sobre otras funciones de la planta, la calidad del
producto o el agroecosistema para el cual está destinado.
La evaluación inicial incluye prestar atención a:
- La actividad del gen introducido
- La herencia estable del gen
- Efectos no buscados sobre el crecimiento de la planta,
el rendimiento y la calidad
Cuando una planta pasa estas pruebas, lo más probable es
que no sea usada directamente para la producción del cultivo
sino que será cruzada con variedades mejoradas. Sucede esto
porque sólo unas cuantas variedades de un determinado cultivo
pueden ser transformadas eficientemente y estas variedades
en general no poseen todas las cualidades que los productores
y consumidores esperan encontrar en las variedades modernas.
La cruza inicial con la variedad mejorada debe ser seguida
de varios ciclos de cruzamientos repetidos con el progenitor
mejorado, proceso conocido como retrocruzamiento. La meta
es recuperar tanto como sea posible del genoma del progenitor
mejorado, con el agregado del transgen del progenitor transformado.
El próximo paso del proceso son los ensayos en múltiples
sitios y en múltiples años tanto en el invernadero como en
los campos para comprobar los efectos del transgen y el desempeño
general de la planta. Esta fase incluye también la evaluación
de los efectos ambientales y la inocuidad alimentaria. Para
más información sobre estos aspectos, pase a la parte de Evaluación
y reglamentación en este sitio Web.
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Ann Fenwick, antigua employada del Departamento de
Suelos and Cultivos, contribuyó al contenido de
esta página.
Última realización : 11 marzo
2004
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